蒋介石在上海发动了四·一二”政变，破坏了第一次国共合作，并且打击了共产党和革命势力。

蒋介石在1926年2月兼任国民革命军总司令，打击共产党和革命势力。

在1926年1月国民党第二届全国代表大会上，当选为中央执行委员、中央常务委员；2月兼任国民革命军总司令。
1926年先后制造“中山舰事件”、“整理党务案”“4.12事件”，打击共产党和革命势力。他相继担任军事委员会主席、国民党中央组织部长、军人部长、国民革命军总司令以及国民党中央常务委员会主席等要职。1926年7月北伐战争开始后，蒋介石率总司令部赴前线指挥作战。国民革命军在工人农民支援下打垮了北洋军阀吴佩孚、孙传芳，湘、鄂、赣、闽四省完全光复，并继续向豫、皖、苏、浙进军。

蒋介石在上海发动“四·一二”政变，破坏了第一次国共合作，1927年4月18日蒋介石在南京另立“国民政府”，与武汉国民政府对峙。

1926年12月，国民党中央党部和国民政府自广州迁往武汉，但蒋坚持要迁都南京，冀图直接控制。
1927年3月，国民党二届三中全会通过《统一党的领导机关决议案》等一系列提高党权、防止个人独裁和军事专制的决议，取消了蒋的中央常务委员会主席和军人部长职务。后蒋介石在上海发动“四·一二”政变，残酷屠杀共产党员和革命群众，并在广东和东南各省“清党”,从而破坏了第一次国共合作。
1927年4月18日蒋介石在南京另立“国民政府”，与武汉国民政府对峙。6月，蒋介石与冯玉祥在徐州开会，取得合作反共协议。由于蒋介石在和汪精卫、李宗仁等派系的矛盾和斗争中孤立无援，被迫于8月下野，10月出访日本寻求支持。回国后，离弃妻妾，与宋美龄于12月1日结婚，从此与宋子文、孔祥熙联姻，通过他们加强与美国的联系。